无菌小鼠在营养微生物组学研究中的应用
供稿：杨亚鹏整理编辑：谢许茵
动物机体是一个由宿主细胞和共生于其体内的细菌组成的超级共生体，其中在人体内肠道菌群的基因数量是人类基因数量的百倍。正常情况下，人体内的菌群处于稳态，参与机体代谢、免疫等正常的生理过程,而菌群紊乱情况下则出现与之相关的疾病如糖尿病等多种疾病，其中营养代谢性疾病是菌群失调相关的一大类疾病。
为了研究菌群与营养的关系，探究肠道菌群在营养研究中的作用，无菌动物是必不可少的工具。无菌动物是指从出生开始，这个动物在其整个生命周期中均生活完全隔离的无菌环境中，其体内和体表不含有任何的微生物。华盛顿大学的JeffreyIGordon教授于年做了一个非常著名的试验，将一个体重较大的肥胖的人的肠道菌群移植到无菌小鼠体内，结果这个定植了肥胖的人的菌群的小鼠体重增加成为一只胖小鼠，该研究揭开了现代微生物组研究的序幕，也揭示了无菌动物对于微生物组研究的不可或缺的重要作用，无菌动物已经成为微生物组研究的金标模式动物，JeffreyIGordon教授利用无菌小鼠建立营养微生物组研究领域，利用无菌动物靶向肠道菌群研究，并寻找合适的菌群导向营养来源，治疗营养不良。
此外，随着营养学研究的深入发展，个性化精准营养也开始被人们所熟知，科学和医学概念的进步导致最近认识到可能没有单一的、一刀切的饮食，由于肠道菌群的差异，不同的人在食用相同的食物后的代谢产物存在差异。理解饮食-微生物群落的相互作用、肠道微生物群落组成的个体性以及利用这些知识制定个性化的营养策略，来将会在改善人类健康方面做出巨大贡献，而无菌动物相关研究则直接证实了微生物组学在精准营养研究中的作用。而在疾病临床营养中，靶向肠道菌群的营养治疗也是一大热点，无菌动物是疾病临床营养-微生物组研究中不可缺少的模型工具。
利用无菌动物靶向肠道菌群治疗营养不良
01
儿童营养不良是一个持续的挑战，不能总是通过改善营养来解决，这是因为在肠道微生物中，某些具有典型特征菌群群落是一些病理状态的媒介。随着无菌小鼠等无菌动物的出现，人类肠道微生物可以有效地移植到无菌小鼠体内，以重现它们相关的表型，科学家们利用这一模型发现，健康儿童的微生物群落减轻了营养不良儿童的微生物群落对生长的有害影响，有研究报道在哺乳动物婴儿时期，长期营养不良会导致生长激素抵抗和发育迟缓，研究表明在小鼠中表明肠道微生物群中的植物乳杆菌菌株通过肝脏中的信号通路维持生长激素活性，从而克服生长激素抗性。这些研究表明，特定的有益微生物有可能被用来解决营养不良综合症，营养不良的儿童表现出肠道微生物群发育受损，对0-3岁健康婴幼儿的肠道菌群进行分析，可以通过菌群的多样性变化定位其成熟程度。
JeffreyIGordon团队将来自6个月和18个月大的健康或营养不良的马拉维供体的微生物移植到喂食马拉维饮食的无菌幼鼠体内，研究结果发现，来自营养不良婴儿和儿童的未成熟微生物群落传递受损的生长表型，未成熟的微生物群将受损的生长、改变的骨形态以及肌肉、肝脏和大脑中的代谢异常传递给受体小鼠，受体动物携带的已移植微生物群中几种具有年龄区分性的分类单元与其生长速度相关，小鼠在接受健康或严重发育不良和体重不足的婴儿的微生物群移植后饲喂于相同饲养空间，前者的微生物群具有年龄和生长区分性的分类群能够入侵后者的微生物群，从而防止了受体动物的生长障碍。在营养不良的供体微生物群中添加两种入侵物种—活泼瘤胃球菌和共生梭菌，也能改善受体动物的生长和代谢异常。这些结果提供了微生物群不成熟与营养不良之间的因果关系的证据，并揭示了潜在的治疗目标和药物。
此外，JeffreyIGordon团队为了模拟肠道病原体和肠道微生物群落成员之间的相互作用是如何导致营养不良的，他们采用了具有代表性的孟加拉国饮食，并在无菌小鼠体内定殖来自2种儿童的粪便菌群，分别为健康儿童的粪便菌群和儿童因营养不良而体重不足，收集的营养不良供体的细菌菌群中包含一种产肠毒素的脆弱拟杆菌菌株(ETBF)，而健康的供体细菌菌群收集包含两种产非毒素的脆弱拟杆菌菌株(NTBF)，分析结果显示产肠毒素的脆弱拟杆菌菌株与其原生菌群群落造成的体重减轻有因果关系，但在引入健康供体菌群时则没有这种关系，此外通过分析发现这种表型可从母鼠传给后代，且表现为三羧酸循环活性受损和酰基辅酶a利用率降低，因此宿主能量代谢紊乱有关，与此同时研究发现NTBF减少了ETBF肠毒素的表达，并减轻了ETBF对其他健康捐赠者的转录组的影响。这些临床前的发现提供了肠道菌群的不成熟与儿童营养不良有因果关系的证据，研究者们确定的区分年龄和生长的分类菌群应有助于直接研究宿主和环境因素对肠道微生物群落发育的影响，它们代表修复或预防肠道微生物群不成熟的治疗目标。
有研究报道特定的有益微生物有可能被用来解决营养不良综合症，无法康复的营养不良儿童的肠道微生物组具有婴儿微生物组的特征，表现出肠道微生物群发育受损，JeffreyIGordon团队证实与年龄相符的成熟的微生物组是对营养做出良好反应的关键。该研究团队利用无菌小鼠与无菌猪构建悉生模式动物，在临床前测试了发展中国家多种易得的食物组合，以观察微生物组的反应，在取得确切的效果后，在临床上检测了一小群营养不良儿童的反应，最后将食物锁定为含有鹰嘴豆、香蕉、大豆和花生粉的补充剂，有助于肠道菌群的成熟，证实促进肠道菌群成熟的辅食可治疗营养不良儿童，此外，研究团队还找到了15种细菌和蛋白质在内的血液标志物，这些标志物代表肠道菌群的成熟，营养不良儿童体内这些标志物的出现标志着营养不良得以恢复。由于这篇文章具有非常重要的实际意义，本研究也被评为年十大科学突破，JeffreyIGordon团队利用无菌小鼠和无菌猪的模型，结合多组学研究技术发现的食物组合，为发展中国家无法康复的营养不良儿童带来了希望，也是靶向菌群研究营养不良的标杆。
无菌动物证实微生物组学在精准营养研究中的作用
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研究报道，肠道菌群的分析已成为营养干预研究中的头等大事，特定饮食因素对肠道微生物生态多样性的影响是目前许多正在进行的研究的主题。基于个体特征的营养干预措施的开发侧重于优化肠道微生物的组成，丰富性和多样性，新兴证据表明，肠道微生物群谱分析应作为精确营养的关键分析元素之一，实际上，在营养代谢性疾病中，肠道菌群的组成和多样性都已被确定为包括代谢综合征，T2D和CVD在内的几种代谢性疾病发展的潜在危险因素，肠道微生物组与之相关的一个方面是它的组成和多样性可以通过宿主遗传来调节疾病发生发展的事实，但与精确营养领域更为相关的是，饮食与宿主遗传背景之间的相互作用也能够调节肠道菌群的组成，因此，在研究其中的相互关系时，无菌小鼠便成为其中的桥梁，因此，利用无菌小鼠模型可形成基因微生物互作的精准营养研究模式。
不同的人对同一种营养食物反应不同，利用数据结合菌群特性，通过算法精准预测每个人对食物营养的效应，这使得个体化饮食干预成为可能，这就是精准营养。肠道菌群在明确每个人对饮食的不同应答，实现精准营养和个性化反应预测中起到了关键作用，肠道菌群在宿主对膳食纤维、能量限制与过剩以及其他膳食成分干预的代谢响应中均扮演了一定角色，精准营养模型的发展需结合微生物组、遗传、表观遗传以及其他生活方式等因素。
研究报道，个性化精准营养支持有益于住院患者，研究报道在超过名住院患者中，发现个性化营养干预可显著改善患者的重要临床结果并降低死亡率，基于营养基因组学和代谢组学数据，可通过饮食干预改变肠道菌群的丰度、组成及活性，影响食物代谢及血糖控制，将技术数据整合可提供个体化营养指导，有效预防和管理2型糖尿病。
饮食成分可直接或间接（通过影响宿主代谢、免疫和肠道屏障等）塑造肠道菌群的组成和功能，遗传和外界因素增加了饮食对菌群影响的复杂性，纤维、脂肪、动物蛋白、添加剂、矿物质、植物活性物质等与菌群互作，影响菌群的免疫调节作用和代谢产物、改变宿主基因表达，在局部和系统层面影响健康和疾病。基于饮食的菌群疗法中，“量身定制”的个性化营养正在起步。
饮食-微生物群相互作用的最新进展报道利用饮食、微生物和宿主相互作用确定个性化营养饮食，通过顿餐食记录和多万次的血糖测量大数据分析后不同人在吃了同一种食物后，血糖变化可能并不完全一样，甚至可能出现截然相反的情况，基于微生物群特征不仅能够准确预测餐后血糖变化，而且针对微生物群短期饮食干预，也展现出了改善餐后血糖升高及其相关代谢的能力。
个性化饮食的设计的其中一种思路就是消除或提供特定的底物来引导特定代谢物产生的变化，如为有益细菌提供它们代谢所需的前体化合物，或者是排除可能产生有毒或有害代谢物的化合物的成分。
插图来源于文献：Kolodziejczyk,A.A.,Zheng,D.Elinav,E.Diet–microbiotainteractionsandpersonalizednutrition.NatRevMicrobiol17,–().
基于微生物的饮食设计，在设计个性化营养饮食时，除了微生物组的组成和功能外，还需要考虑遗传学、临床参数、生活方式和个人的特定目标等数据，来确定所有可能的个性化饮食组合。
目前，基因学研究与营养学研究之间缺乏数据关联分析，疾病治疗过程缺少膳食摄入跟踪评估等问题或是目前慢性病研究面临的困境与挑战，从营养基因组学和营养遗传组学的角度解读了不同基因型患者对药效反应、治疗和生活方式改变的治疗效果差异。未来经多学科协作发展，综合考量多条件之间的综合性和交互性，实现个性化精准治疗，解决疾病问题。
通过营养干预基因微生物互作，改变肠道微生物代谢进而影响宿主代谢，影响疾病发生发展，由于个体基因型的差异导致营养需求差异，我们可以基于宿主不同基因型、菌群，进行营养需求评估，结合基因与微生物互作，实现特色、精准营养供给。
中国每年超过1.5亿人次住院患者、3亿以上院外患者、2千万以上孕妇，2亿以上少年儿童和近2亿老年人口的临床营养需求,将在未来二十年内快速形成万亿元以上市场规模，临床营养产业将成为本世纪最具活力的新兴产业之一。中国国家卫生计生委年第11号公告公布《特殊医学用途配方食品通则》（GB-）、《特殊医学用途配方食品良好生产规范》（GB-），标志着特殊医学用途食品正式纳入国家食品管理体系（普通食品、保健食品、特殊医学用途食品）。而结合肠道微生物研究临床营养需求正在成为新的研究方向，无菌小鼠作为营养微生物组研究的金标模型动物必将推动研究的进展。
无菌动物是
疾病临床营养-微生物组研究中不可缺少的模型
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无菌动物已经形成了基本的研究应用模式，利用与CRISPR可以对基因组进行编辑相同的原理，无菌动物可以对微生物组进行编辑从而成为功能微生物组研究的必备工具（Li,J.,andWei,H.）。
随着我们对肠道菌群可以影响机体健康以及饮食改变肠道菌群组成的了解的增加，越来越多的证据支持全谷物对几种慢性疾病状态下的机体保护作用。Koistinen,V.M等人研究表明富含麸皮的研究饮食提高了C57BL/6J小鼠结肠内容物中甜菜碱化合物的水平与此同时微生物群的组成也发生了变化，富含麸皮的饮食导致几种细菌类群的相对丰度增加，包括增加潜在有益菌或代谢植物分子的细菌，如Akk菌属、双歧杆菌属、红蝽菌科、乳酸菌、Parasutterella和瘤胃球菌属，其中许多与改善健康状况有关，研究者发现与常规小鼠相比，无菌小鼠肠道组织中的甜菜碱化合物水平显着降低，证实肠道菌群参与将甘氨酸甜菜碱代谢为其它甜菜碱化合物，表明麸皮饮食对细菌类群的相对丰度增加也参与了甘氨酸甜菜碱向其他甜菜碱化合物的代谢，从而增加了另一个潜在的化合物组，作为饮食和结肠微生物群的协同代谢效应的介质。
威胁生命的食物过敏在西方的社会中发生了惊人的代际增长，解释这种流行率上升的一种假设是生活方式发生了巨大的变化，这其中包括滥用抗生素、饮食改变、剖腹产和配方奶粉喂养的高比率已经改变了肠道细菌群落，早期生活方式的改变可能特别有害。为了更好地理解共生细菌如何调节人类的食物过敏症状，Feehley,T等人将健康或牛奶过敏(CMA)的婴儿的粪便植入无菌小鼠体内后发现，健康婴儿的菌群可预防小鼠发生牛奶过敏（CMA），而CMA婴儿的菌群无此保护作用，此外两组小鼠的回肠上皮细胞基因表达不同，回肠菌群组成的差异与粪便菌群相似，提示回肠细菌可能调控宿主代谢和免疫从而影响食物过敏，分析回肠差异性表达基因和菌群OTU的关系，结合单一定植实验，鉴定出产生丁酸的梭菌属粪厌氧棒状菌对CMA起保护作用。研究结果表明，肠道细菌对于调节食物抗原的过敏反应至关重要，调节肠道菌群群落的干预措施可能与治疗食物过敏相关。
膳食纤维可经肠道菌群发酵生成短链脂肪酸（SCFA），对人体健康有重要作用，此前研究表明，SCFA生产不足与2型糖尿病等诸多疾病都有关系，（LPZhaoetal.,）研究表明，接受高膳食纤维临床干预辅助阿卡波糖治疗的病人可快速有效地改善2型糖尿病，通过分析患者肠道菌群的变化，鉴定出一组与临床治疗效果显著相关的SCFA产生菌，肠道菌群移植鉴定出的相关菌导致无菌小鼠血糖降低，无菌动物模型为膳食纤维干预糖尿病效果的菌群靶向因果关系发挥重要作用，证实膳食纤维选择性富集的肠道细菌可缓解2型糖尿病，以这些关键细菌为靶点，或可成为个性化营养干预防治2型糖尿病的新手段。
无菌小鼠可作为肥胖营养微生物组研究的重要模型工具，诸多文献报道饮食引起的肥胖症和食物过敏症呈串联上升趋势，但这些富贵病之间潜在的因果关系仍有待检验。MaryamHussain团队证实了高膳食脂肪摄入量、膳食诱导的肥胖以及相关的肠道微生物群落结构变化在食物过敏发病机制中的作用。HFD诱发的肥胖症增强了与肠道效应肥大细胞异常积累，肠道通透性增加和肠道营养不良有关的食物过敏反应，其中肠道菌群多样性降低，部分拟杆菌科丰度增加，证明这与肠道菌群紊乱相关。利用无菌小鼠验证发现HFD症状相关的微生物群可传播给无菌小鼠。此外研究发现，无论是否肥胖，移植了高脂饮食小鼠菌群的无菌小鼠对食物过敏的易感性均会增加，高脂饮食导致的特殊肠道菌群结构可以在无菌小鼠中维持。这些发现确定了HFD引起的微生物变化是实验性食物过敏的危险因素，并使HFD相关微生物群的致病作用与肥胖无关，由于饮食脂肪的过度摄入导致饮食后微生物群的改变可能会增加食物过敏的易感性。
综上所述，无菌小鼠可作为疾病营养微生物组研究的金标模式动物，其推动了疾病营养微生物组学的研究，尤其是营养代谢相关疾病的微生物组学研究。
总结与展望
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微生物组研究的一个主要目标是理解并有能力且安全有效地调节微生物组以改善健康，人们已经开始了解人类肠道菌群在健康和疾病中的作用，肠道菌群的组成受内在机制（例如压力）和外在因素（例如饮食，益生元，益生菌以及包括抗生素等药物）影响。肠道菌群失调已被证明与IBD，IBS和抑郁症有关。很明显，肠道菌群与其宿主的关系是主动的，而不是被动的。微生物代谢物(如SCFAs)影响肠-脑信号传导。肠道微生物群对焦虑、情绪、认知和疼痛有调节作用，通过肠道-大脑轴发挥作用。怀孕期间，母体微生物群落的显著变化会影响新生儿的免疫反应和成熟。摄入益生元或益生菌已被用于治疗一系列疾病，包括便秘、过敏反应和婴儿期感染以及肠易激综合征患者。FMT对于治疗复发性艰难梭菌感染非常有效，并且在将来可能被更广泛地用于诸如代谢综合征等病症。
从越来越多的基础营养学中的研究发现转化为有意义的和与临床相关的饮食建议，成为当今临床营养的主要挑战之一。无菌动物是肠道菌群靶标研究的重要工具，利用体内无菌小鼠模型，通过人源化菌群模型制备方法，重现疾病（尤其是代谢疾病）表型，利用模型筛选功能菌株，结合微生物相关组学技术建立疾病临床营养微生物体系。
综上所述，肠道微生物对健康的影响是多方面的，因此，预计益生菌将与其他营养化合物结合，以实现更强的健康效果。相信随着无菌动物技术与多组学技术的发展和无菌动物在营养微生物组学中应用，精准营养、临床营养研究都会有十足的进步，此外，预计将不同的研究学科结合起来，并在微生物研究中利用新的技术方法，可能会为解决现代生活中的健康问题铺平道路，为人类的健康探索提供保障。
参考文献
1.热心肠
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