文献解析
——LongitudinalMulti-omicsRevealsSubset-SpecificMechanisms
UnderlyingIrritableBowelSyndrome
文献简介
美国梅奥诊所RubenA.T.Mars和英国伦敦帝国理工学院YiYang以共一作发表研究文章，采用肠道菌群-代谢物-靶器官研究策略，对IBS患者的粪便样本（宏基因组+代谢组+色氨酸+胆汁酸）、结肠活检组织（16S+短链脂肪酸+转录组+DNA甲基化组等）和外周血（代谢组）进行了多组学贯穿整合分析，揭示了IBS及其亚型的致病机制。
研究背景
肠易激综合征（IBS）是一种全球流行的疾病，以反复发作的腹痛或不适为特征。肠易激综合症（IBS）是一种普遍存在的疾病，其特征是反复出现腹痛或不适。IBS主要出现在女性中，并且与粪便形式或频率的变化有关，并基于主要便秘形式（便秘为主（IBS-C），腹泻为主（IBS-D）或混合型（IBS-M））。IBS的发病机制包括胃肠动力的改变、肠分泌物、内脏超敏反应、肠道通透性、饮食、宿主基因和环境的影响，这些因素可以调节人体肠道菌群或受肠道菌群的调节。然而目前的动物模型却未能完全模拟IBS病理生理的各个方面，因此需要人体研究来更好揭示肠道菌群与IBS的相互作用。
IBS中的人体研究受到横断面采样和亚型分层的限制，这反映在大量微生物组研究的发现之间缺乏一致性。考虑到胃肠道转运对肠道微生物组的影响，后者进一步增加了变异性。此外，IBS像其他慢性胃肠道疾病一样，以症状缓解和加重期为特征，因此横断面样本无法说明疾病随时间的变化。最后，人与动物研究之间宿主生理的内在差异已成为增进我们对IBS中肠道微生物组机械作用的理解的障碍。
我们对IBS患者的亚组进行了一项纵向研究，整合了包括微生物基因组，宿主转录组和甲基化组在内的多组学测量结果，并评估了宿主功能，并确定了由微生物代谢变化驱动的IBS亚型特异性机制，这与宿主同时发生的变化相对应生理。
研究路线
材料方法
? 纳入排除标准：健康受试者的招募与IBS受试者的年龄，性别和BMI相匹配。
? 参与者和样本数据：包括病史的记录和研究医师的检查，其中记录了身高，体重，BMI和生命体征。此外，研究对象接受了营养学家的咨询，对食物频率问卷（FFQ）和24小时饮食回想问卷进行了解释。其他问卷包括：罗马III级IBS诊断标准，IBS症状严重程度（为IBS参与者每月完成），微生物组健康，肠病问卷（BDQ-6），医院焦虑和抑郁，IBS生活质量以及7天的《肠日记》（为所有参与者每月完成）。
? 标本采集和数据生成：粪便标本在首次访问后通过家庭收集工具完成，然后每月收集至六个月。仅在初次就诊时收集血样（血浆，血清，全血），并在进一步处理后储存在80℃下。通过柔性乙状结肠镜检查从距肛门边缘20-30cm的乙状结肠中获得活检标本。每次手术最多给予两个自来水灌肠剂以清洗结肠。所有内窥镜检查程序均由一名内窥镜检查员（P.C.K.）进行，使用无针大容量（2.8mm）活检钳收集多达12例结肠活检。
? IBS患者（两种亚型，IBS-C22例，IBS-D29例）和健康对照组人群（24例）：粪便样本（纵向连续采样６个月，一次／月）、结肠活检组织(n=42)、外周血样本。
? 尤斯灌流室实验：使用Ussingchamber装置评估活检样品结肠黏膜分泌反应。
? 宏基因组测序：粪便和活检切片中提取DNA并测序。
? 16S扩增子测序：通过扩增16S核糖体RNA基因的V4区对活检样品进行测序。PE。
? 微生物组数据分析：FDR截止值0.25。通过提取所有健康对照（HC）与HC或IBS样本之间的成对差异，计算基于Bray-Curtis差异（BCD）的不规则性（BCDI），并存储这些差异的中位数。HC值的第90个百分位数用作鉴定与HC样品不同的微生物组样品的临界值，去除异常值。
? 代谢组学：血清(90ul)和粪便（mg）样品的1HNMR代谢谱图；通过LC-MS/MS分析血清和粪便的胆汁酸；使用GC-MS/MS进行结肠活检组织SCFA绝对定量；用LC-MS/MS进行粪便（50mg）色氨酸绝对定量。
? 细胞因子测量：定量分析IL-8，IFNg，IL-10，II-18，IL-22，Leptin，VEGF，MIG，IL-1b，IL-17A，IL-1RA，IL-6＆TNFa、TGFb-1。
? RNA测序和分析：从活检样品中提取mRNA，进行转录组测序。
? 甲基化组测序和分析：具有KCpG位点的IlluminaInfinium甲基化EPICBeadChip用于评估从活检样本中分离的基因组DNA中的全基因组甲基化。
? 多组学数据关联分析：使用R中的Maaslin2软件包研究了粪便微生物特征与粪便代谢物之间的关联。将微生物最低丰度和的最低频率分别设置为0.和0.5。经FDR校正的q值的阈值设置为0.25。将线性混合效应模型应用于与被设置为随机效应的受试者的关联。进行结构缺失和可变区的鉴定以及随后与重要代谢物特征的关联。Lasso回归机器学习模型分析整合25名IBS患者和13名健康对照者宿主基因表达与微生物组和代谢组学数据。
? 体外和体内次黄嘌呤的消耗实验：细菌在Mega培养基中培养。过夜生长后，使用LC-MS测定培养上清液中的次黄嘌呤水平。在6周龄的无菌SwissWebster小鼠上进行了单菌落实验。将三只雌性小鼠口服在BHI培养基+0.01％半胱氨酸中生长的2*CFU过夜细菌培养物进行口腔灌胃，并在实验过程中共同饲养。在管饲后第4天，处死小鼠并收集盲肠内容物。测定盲肠内容物中次黄嘌呤和黄嘌呤的总浓度。
主要结果
共有77位参与者提供了至少一个时间点的粪便样本，而42位参与者同意接受柔性乙状结肠镜检查，从而使我们能够纵向获得结肠活检。图1A–1C和S1A和表S1概述了研究对象的样本类型和人口统计学，以及广泛的元数据，包括药物使用，医院焦虑和抑郁评分以及IBS症状严重程度评分（SSS）。研究对象在每次就诊时提供饮食回想（表S1）和症状严重程度。在自我识别的症状发作期间，IBS患者可以选择在常规探访之间提供额外的粪便样本和完整的症状严重程度调查表，这被定义为两次探访之间症状的严重恶化。共有12位受试者在爆发时提供了额外的粪便样本（IBS-C和IBS-D分别为6位）。
比较不同时间点时，在各个时间点观察到的HC和疾病组之间的分类单元丰度差异非常不一致，并且与平均数据中观察到的变化不重叠（图S1B）。当使用平均数据而不是单时间点数据时，我们发现多个链球菌属物种的丰度明显更高。与HC（log2（FC）1，在Mann-WhitneyU测试中，FDR0.25）相比，IBS-C和IBS-D以及复合IBS组分别进行了测试（图S1C；表S2）。此外，我们发现与HC相比，IBS-D中新近鉴定出的门合生菌的丰度要低得多（log2（FC）2.1，FDR0.；图S1D；表S2）。我们还发现，个体间变异高于个体内部变异，这支持了我们对每个个体的纵向数据进行平均的方法（STAR方法，t检验p0.）。这些发现凸显了在慢性疾病中进行纵向采样的必要性，以可靠地识别使用横截面采样可能遗漏的微生物群变化。
基于Bray-Curtisβ多样性的PCoA表明，IBS中的粪便微生物群组成按亚型聚集，IBS-D和IBS-C与HC样品以及彼此之间显示出明显不同的分散性（图1D和1E）。为了进一步确认β多样性的差异，我们计算了基于BrayCurtis差异（BCD）的异常（BCDI）得分。IBS-C的BCDI分数显著提高（针对受试者的线性混合效应模型校正；图1F）。当认为样本在HC分布的第90个百分位点之外是不正常的时，我们发现比IBS-D更多的IBS-C样本是不正常的（IBS-C为31.7％，IBS-D为14.1％，比例相等测试p0.）。
与HC和IBS-D受试者相比，IBS-C患者的粪便微生物群组成随时间表现出更大的变异性（图1G）。此外，与IBS-D样本相比，平均IBS-C粪便样本的香农多样性更高（ANOVA，TukeyHSDp值为0.）。
然后，我们测试了管腔和粘膜相关微生物群的差异。这些差异在IBS中是相关的，因为由粪便形式的差异定义的疾病亚型部分是上皮液向管腔分泌的改变的结果。粪便样品中结肠黏膜的微生物组成与腔微生物群有显着差异（图1H）。与HC相比，IBS患者的粘膜相关菌群的特征是变形杆菌水平明显较高（图S1G）。与IBS-D或HC相比，IBS-C患者的与黏膜相关的微生物群与其各自的腔内微生物群相似度较低（图1I）。这可能反映出IBS-C的迁移时间较长，而群落之间有更多的时间分化。此外，IBS-C患者的粘膜相关菌群的个体内变异性随时间变化更大，这与我们在腔内菌群中观察到的相似（图1J）。
我们观察到了重度IBS-D（SSS）与轻度中度IBS-D（SSS；10倍，MannWhitneyFDR0.1，表S2）相比超过20个乳酸杆菌属的较高相对丰度。这与受试者食用益生菌或乳制品无关（图S2A–S2C）。
粪便宏基因组学数据功能富集分析发现FDR
0.1时，有74个KOterms与严重的IBS-C相关，有44个与严重的IBS-D相关。与轻度中度IBS相比，重度IBS-C和IBS-D中均发现了醇脱氢酶
（ADH）的KOterms（重度IBS中的高0.6log2（FC））。这些ADHKOterms与双歧杆菌和链球菌正相关。这些数据表明，ADH活性可能与腹痛有关，腹痛是IBS-C和IBS-D共同的主要症状。
此外，我们发现记录为Bristol粪便规模和排便前的腹痛的粪便形式与特定细菌和代谢产物有关。
代谢组学与生理学测量结果相结合，为深入了解肠道菌群代谢对胃肠功能的影响提供了机制
NMR光谱显示，与HC相比，IBS-C患者粪便样本中的短链脂肪酸（SCFA）丙酸酯，丁酸酯和乙酸酯显着降低（图2A）。
与腔内代谢产物一致，与HC组相比，IBS-C组的结肠黏膜活检样品中的乙酸盐也显着减少（图2B）。
IBS-C患者对5-HT的结肠活检的分泌反应显着低于HC（图2C），这与IBS-C患者所见的粪便形式一致。
IBS-D患者粪便样品中的色氨酸和色胺都显着增加（图2D；图S3B），因此可能部分归因于IBS-D粪便中水分的增加。我们证实这些代谢物的变化与蛋白质摄入的饮食差异无关（图S2）。我们发现IBS患者和HCs的结肠上皮能够由色胺引起的液体分泌，因此观察到的变化可能是由于色胺浓度的变化所致。
代谢组学与生理学测量结果相结合，为深入了解肠道菌群代谢对胃肠功能的影响提供了机制
我们检查了IBS中BAs的微生物转化是否存在差异，这可能导致肠道分泌物改变。发现与IBS相关的BA标记存在差异，与HC相比，IBS-D患者粪便样品中未结合的初级BA含量显着较高，IBS-C患者粪便样品中未结合的初级BA含量显着较低（图2E）。
为了确定色胺和主要BA水平差异的生理相关性，我们测量了从三组中获得的结肠活检中Isc的差异。正如我们在gnotobiotic小鼠中的发现所期望的那样，我们发现IBS-D患者的结肠活检也显示出明显更高的基线Isc（图2F），这与我们上文所述的色胺和主要BA的分泌作用一致。
5.整合微生物组-代谢组学分析确定了IBS中的新型微生物代谢途径。
除了上述靶向方法外，我们还采用了非靶向代谢组学方法来确定可能导致IBS病理生理变化的新型微生物途径。与HC相比，IBS-C患者粪便样品中的赖氨酸，尿嘧啶和次黄嘌呤均显著降低（图3A-3C；图S4C-S4F）。IBS-D患者的次黄嘌呤含量也较低，尽管与IBS-C的意义不同。
在KO中，我们发现IBS-C中的黄嘌呤脱氢酶/氧化酶（XO;1.17.1.4）和黄嘌呤磷酸核糖基转移酶
（XPRT;2.4.2.22）模块相对于HC有所升高（图3D）。
XPRT从黄嘌呤单磷酸中释放出黄嘌呤，这是抢救嘌呤的第一步。在下游，XO是一种底物特异性低的酶，可作用于黄嘌呤或次黄嘌呤以产生尿酸。这些XPRT和XO模块的水平较高，表明IBS患者的肠道菌群对嘌呤的分解作用增加。
微生物基因区域分析证实与胆汁酸，丁酸和次黄嘌呤代谢有关
为了进一步阐明微生物对IBS中鉴定的代谢物丰度的贡献，我们首先基于线性模型进行了直接多元相关分析。这确定了HC样品有60种重要的特异相关代谢物种类，IBS-C有28种，IBS-D有46种（表S4）。所有组均无相关性。HC和IBSC或IBS-D中存在12个。IBS-C和IBS-D子组都存在2个相关性。
通过鉴定某些微生物群落完全缺失的缺失区（DR）或在某些微生物群落中显示可变丰度的可变区（VR），该分析可以鉴定参与代谢物生产或消耗的微生物基因。观察到的VR的最强相关性是来自Lachnospiraceaesp3_1_46FAA与次黄嘌呤的单个区域（图4A和4B）。
微生物代谢会导致次黄嘌呤水平的升高
我们将Hungatellahathewayi作为阳性对照，因为它与XOKEGG术语高度相关。所有这些菌株均属于梭菌纲。长双歧杆菌ATCC被包括作为阴性对照，因为它不编码XO（pBLAST分析证明）。
与长双歧杆菌相比，来自2个Lachnospiracea菌株和H.hathewayi的生长培养基中次黄嘌呤水平显着降低（图4C）。
为了确定Lachnospiraceae在体内是否也消耗次黄嘌呤，我们对带有Lachnospiraceasp2_1_58FAA或长双歧杆菌，在饮用水中补充了次黄嘌呤的无菌小鼠进行了单菌落培养（图4D）。与长双歧杆菌定植的小鼠相比，定植有Lachnospiraceaesp2_1_58FAA的小鼠的盲肠内次黄嘌呤水平明显降低（图4E）。
IBS患者发作时肠道微生物组和微生物代谢产物的改变
为了进一步证实症状可能加剧的微生物基础，我们检查了在提供额外样本的患者亚群中，自我报告的症状恶化（发作）时收集的额外粪便样本。
与非发作基线合并的IBS样本相比，发作样本显示出更高的BCDI（图5A和5B），与各个IBS子组的平均样本相比，发作样本的Shannonα多样性更低（图5C）。
在将IBS患者作为一组时，以及在IBS-D和IBS-C患者中，特定细菌类群都与发作显着相关（合并IBS的种类为种，IBS-C的种类为40种，IBS-C的种类为7种）。这些重要的物种在爆发期间几乎普遍减少。然而，两种亚型的发作样品中古生菌的一种，即Halobiformanitroatireducens，一直都升高（图5D）。这种古细菌能够减少硝酸盐，硝酸盐是一种替代的呼吸形式，已被确定为IBS-C中能量代谢相关的KOterms之一，这些terms以较高的丰度存在。
IBS-C和IBS-D患者的发作样本中的原发性BA显着升高（图5E和5F），这引起了人们对它们对腹痛的潜在影响的推测，这对于这两种亚型都是常见的。
微生物组和代谢组学数据与转录组和表观遗传学差异相结合
为了确定微生物代谢对宿主功能的影响，我们首先比较了在结肠活检组织中观察到的转录和表观遗传学变化（图S6；表S6）。我们还通过构建跨组学相关网络，将转录组数据与代谢物和微生物群的丰度相集成，从而以无针对性的方式，使用这些数据来确定推定的宿主-微生物-代谢相互作用（图S7；表S7）。
比较IBS-C和HC或IBS-D和HC（1绝对log2（FC）变化且p0.05）时，我们分别鉴定出82个和78个DEG，两个比较中有17个重叠基因（图S6A–S6D；表S6）。
KEGG途径富集分析显示，IBS患者的免疫和炎症相关途径富集（图S6F）。IBS-C的丰富类别包含前列腺素D2合成的基因，其参与调节平滑肌收缩
（PTGDS），B细胞对抗原攻击的反应（CD19和CD22）以及通过HLAII类分子的抗原呈递（HLA-DQA1和HLA-DQB1）。值得注意的是，我们发现血液或结肠活检样本中以前与IBS有关的任何促炎细胞因子均无显着变化。
对于表观基因组分析，我们专注于差异甲基化区域（DMR）。比较IBS-C和HC时，我们检测到54个DMR，比较IBS-D和HC时，我们检测了75个DMR，比较IBS-C和IBS-D时，检测到39个DMR（图S6E）。接下来，我们检查了属于DMR的DE基因，确定了两个对于肠道分泌重要的基因KCNE4和AQP1，它们在IBS-D中的表达水平较低（表S6）。
微生物组和代谢组学数据与转录组和表观遗传学差异相结合
为了更好地了解IBS-C中HLA途径的含义，我们更详细地检查了基础HLAII类基因，并寻找这些基
因与其他组学的相关性。HLAII类复合物存在于抗原呈递细胞（APC）上，也存在于胃肠道上皮细胞上，并且通过呈递源自细胞外蛋白的肽，在免疫系统中发挥重要作用。我们发现，与HC活检相比，IBS-C活检组织中HLA-DQA1和HLA-DQB1分别编码HLAII类分子的a和b链的表达高4倍（表S6）。
此外，HLA-DQB1之前是DMR，表明其表达可能是由于IBS-C中甲基化的差异所致。我们在腔内跨数据集相关网络（图S7B；表S7）中发现了HLA-DQA1和寻常型拟杆菌之间的相关性，这引发了
人们对（细菌）抗原在IBS-C中的潜在作用的推测。
微生物组和代谢组学数据与转录组和表观遗传学差异相结合
通过应用lasso回归模型采用了一种功能强大的基于机器学习的集成方法，并使用它来识别其他基因转录物和基因代谢物关联（图6；表S7）。在该网络中，乙酸盐和PGLYRP1和KIFC3基因周围存在一个枢纽（图6B）。这可能是相关的，因为乙酸盐是一种代谢产物，在IBS-C的粪便和活检样品中都以较低的丰度存在。PGLYRP1是一种模式受体，可与革兰氏阳性细菌的鼠源肽肽聚糖（PGN）结合，并可以通过干扰肽聚糖的生物合成而导致杀菌活性。实际上，该基因与革兰氏阳性细菌肽链球菌科的广泛家族负相关。KIFC3是小带黏附维持所需的负端微管依赖性运动蛋白，因此与屏障功能有关。这说明使用各种组学集成方法会产生大量假设，这些假设可用于将组学数据层中观察到的变化进行上下文化关系串联。
多组学整合确定结肠上皮中的嘌呤饥饿是潜在的IBS新机制
我们发现IBS-C和IBS-D中粪便次黄嘌呤的含量显着降低，确定了微生物次黄嘌呤的降解导致肠道次黄嘌呤水平降低，并确定了功能性变化，表明IBS-C粪便中微生物组导致嘌呤降解的增加。
多组学整合确定结肠上皮中的嘌呤饥饿是潜在的IBS新机制
我们发现IBS-C和IBS-D中粪便次黄嘌呤的含量显着降低，确定了微生物次黄嘌呤的降解导致肠道次黄嘌呤水平降低，并确定了功能性变化，表明IBS-C粪便中微生物组导致嘌呤降解的增加。
由于次黄嘌呤是宿主-微生物共代谢物，因此其库可同时受到微生物和宿主代谢的影响。为了确定宿主对次黄嘌呤池减少的反应，我们检查了结肠活检组织中嘌呤代谢基因表达的变化。当与HC相比时，两种IBS亚型的结肠活检中人黄嘌呤氧化酶的基因表达（由XDH基因编码）均升高，并且在两个时间点均一致，log2（FC）在0.26至0.65之间（图7B）。这表明次黄嘌呤池的耗尽可能是来自微生物组和宿主的XO活性增加的结果。肠上皮细胞的嘌呤从头合成能力有限，而是主要依靠挽救途径进行腺苷酸的生物合成（图7C）。
为了确定由于次黄嘌呤池耗尽而对宿主产生的次要作用，我们检查了嘌呤挽救途径中可能的转录变化。嘌呤挽救途径中的第一个基因嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）在IBS-C和IBS-D中均表达高2倍（图7A），并且在IBS患者中PNP表达与次黄嘌呤水平呈负相关（图7D）。
这些发现提出了一种模型，其中微生物群和宿主对嘌呤核苷酸的降解增加，从而在结肠组织中引起代谢应激。反过来，这可能会通过增加嘌呤挽救而导致代偿性反应。使用这种多组学观点，我们认为低水平的嘌呤核苷酸可能导致较低的上皮能量状态和粘膜修复能力，这可能部分是IBS的病理生理基础。
总结
本研究通过IBS患者肠道微生物组、代谢组、宿主表观基因组和转录组的综合纵向多组学分析发现：IBS-C患者中短链脂肪酸和嘌呤减少以及IBS-D中色胺和胆汁酸的积累可能是其致病因素，同时结合体外培养和动物水平验证了表达XO的关键菌Lachnospiraceaesp.
2_1_58FAA以及结肠组织中人黄嘌呤氧化酶(XDH基因编码)的高表达是减低次黄嘌呤水平从而导致IBS致病的关键因素。从多个组学层面揭示了IBS中肠道菌群-代谢物-靶器官相互作用新机制，为今后的研究提供了多种新的治疗靶点。
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